|
|
Vývoj modelového systému pro studium transportu chloridových iontů u buněk plicního epitelu pacientů trpících cystickou fibrosou
Pecková, Kateřina ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
U onemocnění zvaného cystická fibróza dochází k narušení fungování proteinu CFTR, jehož hlavní funkcí je transport chloridových iontů z buňky. Stanovení schopnosti CFTR kanálu transportovat chloridové ionty je považováno za jediný způsob, jak stanovit jeho aktivitu. V této práci byl transport chloridových iontů prostřednictvím CFTR kanálu studován u buněčných linií plicního epitelu zdravých pacientů (NuLi-1) a pacientů trpících cystickou fibrózou (CuFi-1). Pro studium byla vybrána a optimalizována metoda fluorescenčního značení za použití fluorescenčního barviva N- (ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxychinolinu (MQAE), které poskytuje fluorescenci v modré oblasti spektra a je nejcitlivější fluorescenční sloučeninou vůči chloridovým iontům, která byla doposud navržena. V rámci vývoje optimální metody byly pomocí fluorescenčního značení testovány dva způsoby měření transportu chloridových iontů a to stanovení jejich množství uvolněných buňkou do pufru obsahujícího MQAE a stanovení jejich množství v buňce přímo obarvené MQAE. Druhé stanovení se ukázalo jako vhodnější a reprodukovatelnější metoda pro prokázání transportu chloridových iontů. Zároveň byl sledován vliv sloučeniny forskolinu, která zvyšuje intracelulární koncentraci cAMP a tím urychluje otevírání CFTR kanálu, díky čemuž může být ověřeno, zda...
|
|
|
Izolace bakteriálního flagelinu jako imunogenu pro přípravu protilátek pro pacienty s cystickou fibrosou
Supová, Veronika ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cystická fibróza (CF) je autozomálně recesivní onemocnění způsobeno mutacemi v CFTR genu. Důsledkem této mutace je špatná funkce chloridového kanálku tvořeného CFTR proteinem. Díky této abnormalitě se sníží či ztratí funkce transportu chloridových iontů a tím dojde k utvoření hlenu nazývaného mukus. Mukus se nejčastěji utváří v plicích a je ideálním prostředím pro patogenní bakterie, jako například Pseudomonas aeruginosa (PA). Pseudomonas aeruginosa je aerobní, gramnegativní, podmíněný patogen, vyskytující se u pacientů se sníženou imunitou či právě u pacientů s CF, kteří jsou často hospitalizováni v nemocnici. Obsahuje jeden polární bičík, jehož vlákno je mimo jiné složeno z proteinu flagelinu. Právě bičík je jedním z nejdůležitějších virulentních faktorů bakterie PA. Tato práce je zaměřena na izolaci flagelinu z bičíku bakterie PA, který poslouží jako antigen pro přípravu profylaktických protilátek pro pacienty s CF. Flagelin byl izolován pomocí čtyř metod založených na různých kombinacích centrifugačních a precipitačních kroků. Tyto publikované metody bylo třeba optimalizovat tak, aby se podařilo izolovat flagelin. Finální preparáty a meziprodukty byly analyzovány SDS-elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a přítomnost flagelinu byla ověřována hmotnostní spektrometrií. Z výsledku vyplývá, že...
|
|
|
Využití slepičích protilátek proti lektinu PAIIL pro prevenci infekcí Pseudomonas aeruginosa u pacientů s cystickou fibrosou
Kubíčková, Božena ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Anzenbacherová, Eva (oponent) ; Eckschlager, Tomáš (oponent)
Cystická fibróza (CF) je jedním z poměrně běžných dědičných onemocnění, způsobené mutací genu kódujícího protein CFTR, který tvoří chloridový kanál, jež významně ovlivňuje homeostázi iontů a s ní spojené hospodaření buňky s tekutinami. Toto onemocnění postihuje zejména dýchací a trávicí soustavu, avšak z hlediska ohrožení života je nejzávažnější postižení respiračního traktu. Pacienti s CF trpí častými a opakovanými infekcemi dýchacích cest, které vedou k rozvoji chronického zánětu a postupné destrukci plicní tkáně. Tyto infekce plic vyvolané většinou oportunním patogenem Pseudomonas aeruginosa, který je specifický pro pacienty s CF, jsou nejčastější příčinou morbidity a mortality těchto nemocných. V současnosti jsou v terapii infekcí Pseudomonas aeruginosa používána antibiotika, avšak vzhledem ke vzniku rezistencí jsou hledány nové způsoby antibakteriální terapie. Vedle aktivní imunizace pacientů s CF proti Pseudomonas aeruginosa nabízí slibné možnosti pasivní imunizace pacientů pomocí specifických slepičích protilátek cílených proti tomuto patogenu. Cílem předkládané disertační práce bylo proto ověřit profylaktický potenciál slepičích protilátek IgY proti virulenčnímu faktoru Pseudomonas aeruginosa - lektinu PAIIL a dále vyvinout experimentální zvířecí model napodobující podmínky v respiračním...
|
|
|
Vývoj antibakteriálních protilátek pro pacienty s cystickou fibrosou
Vašková, Michaela ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Autozomálně recesivní onemocnění cystická fibrosa (CF) způsobené mutacemi genu CFTR ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator") vede k absenci či defektům CFTR proteinu s funkcí chloridového kanálu. Pro toto onemocnění je typická zejména náchylnost k bakteriálním infekcím dýchacího ústrojí z důvodu hromadění zahuštěného hlenu a pozměněné glykosylace v plicích. Tyto infekce nejčastěji způsobuje bakterie Pseudomonas aeruginosa (PA), k jejíž patogenitě přispívá i lektin PA-IIL. Tento lektin má vysokou afinitu k L-fukose a patří mezi adhesiny PA. Tato práce je zaměřena na studium vlivu anti-PA-IIL protilátek izolovaných z vaječných žloutků a multivalentních inhibitorů PA-IIL na bázi fukosy na adherenci PA k buňkám plicního epitelu. Protilátky byly izolovány z vaječných žloutků slepice před a po imunizaci lektinem PA-IIL. Specifické anti-PA-IIL protilátky byly získány afinitní chromatografií na koloně s imobilizovaným PA-IIL. Metodou ELISA byla ověřena schopnost těchto protilátek rozpoznat PA-IIL. Přítomnost PA-IIL v bakteriální kultuře Pseudomonas aeruginosa (PAK, ST 1763) a schopnost protilátek rozpoznat tento bakteriální lektin byla ověřena pomocí metody Western blot s následnou imunodetekcí. Byly též zjištěny vhodné podmínky kultivace pro expresi tohoto lektinu. Vliv protilátek na adhezi...
|
|
|
Vývoj modelového systému pro studium transportu chloridových iontů u buněk plicního epitelu pacientů trpících cystickou fibrosou
Pecková, Kateřina ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
U onemocnění zvaného cystická fibróza dochází k narušení fungování proteinu CFTR, jehož hlavní funkcí je transport chloridových iontů z buňky. Stanovení schopnosti CFTR kanálu transportovat chloridové ionty je považováno za jediný způsob, jak stanovit jeho aktivitu. V této práci byl transport chloridových iontů prostřednictvím CFTR kanálu studován u buněčných linií plicního epitelu zdravých pacientů (NuLi-1) a pacientů trpících cystickou fibrózou (CuFi-1). Pro studium byla vybrána a optimalizována metoda fluorescenčního značení za použití fluorescenčního barviva N- (ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxychinolinu (MQAE), které poskytuje fluorescenci v modré oblasti spektra a je nejcitlivější fluorescenční sloučeninou vůči chloridovým iontům, která byla doposud navržena. V rámci vývoje optimální metody byly pomocí fluorescenčního značení testovány dva způsoby měření transportu chloridových iontů a to stanovení jejich množství uvolněných buňkou do pufru obsahujícího MQAE a stanovení jejich množství v buňce přímo obarvené MQAE. Druhé stanovení se ukázalo jako vhodnější a reprodukovatelnější metoda pro prokázání transportu chloridových iontů. Zároveň byl sledován vliv sloučeniny forskolinu, která zvyšuje intracelulární koncentraci cAMP a tím urychluje otevírání CFTR kanálu, díky čemuž může být ověřeno, zda...
|
|
|
Slepičí protilátky jako prostředek pasivní imunizaci nemocných cystickou fibrosou
Hadrabová, Jana ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cystická fibróza (CF) je vrozené onemocnění zejména dýchacích cest a zažívacího ústrojí. Přenos je autozomálně recesivní, nemoc spočívá v mutaci genu pro protein CFTR, který funguje jako iontový kanál pro přenos chloridových aniontů. Důsledkem omezení jeho funkce je výrazné zahuštění plicního sekretu, ve kterém se pak snadněji zachytávají a rostou specifické mikroorganismy, zejména Pseudomonas aeruginosa. Infekce je nejprve léčena pomocí antibiotik, bakterie se však vůči nim brzy stávají rezistentní. Vzniká chronický zánět, jehož následkem je jizvení plicní tkáně (fibrosa). Zejména kvůli rezistencím vůči antibiotikům jsou hledány nové metody léčby pacientů s CF. Takovou metodou by mohla být pasivní imunizace pomocí slepičích protilátek IgY, které jsou specifické proti virulenčním faktorům Pseudomonas aeruginosa a jsou schopny je neutralizovat. Tyto protilátky je možné z roztoku pomocí nebulizátoru přeměnit na aerosol, který by mohli pacienti vdechovat. Protože by, vzhledem ke své struktuře, samy mohly potenciálně způsobovat zánětlivé reakce, bylo potřeba vyzkoušet inhalaci zdravými jedinci. K tomu bylo využito potkanů Wistar, jako experimentálního modelu. Nejprve byly protilátky izolovány, pak byl enzymaticky odštěpen fragment Fab a byla provedena purifikace. V inhalačním experimentu byl použit...
|
host ::
RSS.